Scheda di dettaglio

 

Metodo per l'isolamento di vescicole extracellulari intatte

L'invenzione riguarda metodi e composizioni per l'isolamento rapido di vescicole extracellulari (Evs) mediante un approccio che consente il loro recupero come vescicole intatte. L'isolamento di EVs, in particolare di exosomi, da fluidi biologici complessi, con metodi che preservino le loro caratteristiche fisiche Ŕ fondamentale per le applicazioni a valle di tale isolamento. Ad oggi sono state sviluppate diverse tecniche di isolamento di exosomi, tra cui: ultracentrifugazione differenziale, tecniche basate sulle dimensioni, tecniche di cattura immunologiche. Il metodo dell'invenzione utilizza una strategia di immobilizzazione nota come DNA directed immobilization (DDI). La DDI Ŕ stata introdotta inizialmente nella fabbricazione di microarray di proteine al fine di studiare eventi biologici che coinvolgono proteine e peptidi. In tale approccio sequenze oligonucleotidiche legate ad un substrato solido legano in modo selettivo proteine (anticorpi) marcati con oligomeri ad essi complementari. Specificamente, nella presente invenzione, un anticorpo Ŕ codificato da una sequenza di DNA specifica legata ad esso in modo covalente e si lega alla sonda complementare di DNA a singolo filamento presente sulla superficie di micro-particelle mediante l' ibridazione DNA/DNA sequenza specifica. Sfruttando questa strategia di immobilizzazione per legare gli anticorpi diretti contro le proteine di membrana presenti sulle EV, Ŕ possibile esguire una cattura reversibile di esosomi sulla superficie delle particelle magnetiche in quanto una reazione enzimatica, catalizzata da DNAse, consente di tagliare il linker a DNA mediante il quale gli anticorpi sono immobilizzati e di rilasciare in soluzione esosomi intatti. I metodi convenzionali utilizzati per rilasciare gli exosomi basati sulla rottura del legame con antigene-anticorpo causano gravi danni alle EV in quanto richiedono l'uso di tamponi con pH bassi. Anche i metodi basati sulla denaturazione del DNA, che richiedono cambiamenti delle proprietÓ fisiche (ad esempio riscaldamento e sonicazione) o condizioni chimiche drastiche (come il trattamento alcalino, formammide e DMSO) non sono compatibili con la stabilitÓ delle EV. La novitÓ dell'invenzione si basa sull'uso della strategia DDI applicata alla cattura di exosome ma soprattutto sull'uso di DNAse per rilasciare EV integre.

 
 


Inventori

  • Chiari Marcella (ICRM)
 
 


TitolaritÀ

  • Consiglio Nazionale delle Ricerche
 
 


Classificazioni

  • microrganismi o enzimi e loro composizione, propagazione, conservazione, mantenimento di microrganismi, mutazioni/ingegneria genetica, mezzi di coltura
 
 


Settore Tecnologico

  • biotecnologie per la salute
 
 


Keyword

  • Exosomes purification, DNA directed immobilization, DNAse, DNA linker, exosome release
 
 


Vantaggi

1) Resa elevata di cattura di esosomi, elevata specificitÓ 2) PossibilitÓ di rilascio selettivo di sottopopolazioni di esosomi utilizzando DNAsi specifiche per determinate sequenze oligonucleotidiche 3) Rilascio di esosomi interi che non subiscono deformazioni e che pertanto possono essere analizzati con metodi di Imaging (TEM, SP-IRIS)

 
 


Applicazioni

 

fonte dati: "Gestione Trovati" | brevetti.cnr.it | www.cnr.it | Consiglio Nazionale delle Ricerche | P.le Aldo Moro, 7 | 00185 Roma